Nieuwe optische technieken maken levende cel zichtbaar

  'Het ontwikkelen van nieuwe technieken en apparatuur hoort bij de missie van de vakgroep Moleculaire cytologie. Hoewel onze groep een biologische achtergrond heeft en nu verbonden is aan de sciencefaculteit zijn er sinds de jaren zeventig steeds een paar fysici werkzaam. Dat begon met professor Fred Brakenhoff, die indertijd de eerste confocale microscoop ontwikkelde en daarvoor in 1989 de Jacob Kistemaker-Prijs kreeg. Daarmee konden de wetenschappers cellen en bacteriën, onderwerp van onderzoek van deze groep, bestuderen met hoge resolutie en zonder dat ze hun monsters hoefden te beschadigen zoals het geval is bij de elektronenmicroscoop.'

Müller begon zes jaar geleden als postdoc bij de groep. 'Na mijn promotie wilde ik niet verder in het onderzoek. Na drie jaar werkervaring in het bedrijfsleven, wist ik echter zeker dat ik in de wetenschap verder wilde. Gelukkig was het voor professor Brakenhoff geen nadeel dat ik een tijd uit de academische wereld geweest was, hij vond het zelfs een voordeel.' Müller heeft zich over de afgelopen zes jaar met verscheidene projecten beziggehouden: 'Ik begon met de vraag of niet-lineaire optische technieken een rol kunnen spelen bij het ontwikkelen van een microscoop, die niet, zoals de gewone microscoop, gebruik maakt van een fluorescerend label dat aan de cel wordt toegevoegd.' Een dergelijk label kan toxisch zijn en het is een toevoeging aan de cel. In het kader van de rolling grant hebben de wetenschappers daarom een optisch alternatief ontwikkeld.

Versterking
'Als basis hebben we gekozen voor Ramanspectroscopie, waarmee we met infrarood licht bij kamertemperatuur informatie verkrijgen over de vibratietoestand van moleculen', legt Müller uit. 'Hoewel de Ramanspectra ondanks de complexe omgeving zelfs bij kamertemperatuur duidelijk zijn, is het signaal erg zwak, vaak zelfs vele malen zwakker dan de fluorescentie die de cel zelf uitzendt. Daarom versterken we het Ramansignaal met een maximale factor van 108 door coherente anti-Stokes Raman scattering, kortweg CARS, toe te passen.' CARS bestaat al sinds de jaren zestig van de twintigste eeuw, maar de onderzoekers passen de techniek nu voor het eerst in combinatie met een microscoop toe. 'We versterken het Raman-verstrooiingsproces door gebruik te maken van drie laserpulsen. De eerste twee pulsen hebben een frequentieverschil dat exact gelijk is aan een specifieke vibratiefrequentie van het molecuul dat je wilt bestuderen. Van de meeste moleculen zijn de vibratiefrequenties bekend. Deze eerste twee pulsen zorgen voor een zeer efficiënte excitatie van de gewenste vibratie. De derde laserpuls genereert vervolgens het signaal dat de eigenschappen heeft van een laserbundel. Het signaal treedt in één specifieke richting als een bundel uit. Dit signaal meten we dan vervolgens terwijl we het preparaat in alle drie dimensies aftasten. Doordat het signaal op een niet-lineaire wijze afhangt van de laserpulsen, wordt het uitsluitend gegenereerd in het focus van de bundels. Hierdoor kunnen we, na analyse van de signalen, een driedimensionaal beeld reconstrueren, dat de ruimtelijk verdeling van de gekozen vibratie weergeeft.' Op deze wijze kun je slechts één enkele vibratietoestand tegelijk bestuderen. Een alternatief is een breedbandige laser te gebruiken waardoor een serie vibraties wordt aangeslagen.

Truc
De Amsterdamse onderzoekers gebruiken een smalbandige laser (golflengte 700 nanometer) met pulsen van ongeveer 10 picoseconden in combinatie met een breedbandige laser (golflengtes instelbaar tussen 700 en 900 nanometer) die pulsen van ongeveer 100 femtosecondes uitzendt. Deze twee pulsen moeten tegelijkertijd in het monster aankomen. De controle over de tijdsresolutie is dus zeer belangrijk. Daarnaast dispergeren de lensjes van het microscoopobjectief waar de pulsen doorheen moeten het licht. Dus ontwikkelden de wetenschappers ook daarvoor een trucje: vóór het passeren van het microscoopobjectief vindt omgekeerde dispersie plaats. Het objectief trekt dit weer recht.