De moleculaire structuur van eiwitbrokstukken
Vrijwel alle functies van de cel worden uitgevoerd door eiwitten. Om de werking van eiwitten te begrijpen moet hun structuur goed bekend zijn. Tot op heden wordt de structuur vastgesteld door enzymen eiwitten in zogeheten peptiden te laten knippen, daarna die peptiden verder op te breken en uiteindelijk met een massaspectrometer het moleculaire gewicht van de fragmenten te bepalen. Daaruit valt de oorspronkelijke volgorde van de samenstellende aminozuren te bepalen en de eiwitstructuur te reconstrueren. Tijdens het opbreken van de peptiden ontstaan allerlei fragmenten waarvan de massa's weliswaar goed bekend zijn, maar waarvan de moleculaire structuren nog vrijwel onbekend zijn. Onderzoekers van het FOM-Instituut voor Plasmafysica Rijnhuizen in Nieuwegein en het Duitse Krebsforschungszentrum in Heidelberg hebben nu met behulp van infraroodstraling uit de vrije-elektronenlaser FELIX in Nieuwegein weten aan te tonen dat een bepaald soort fragmenten ringvormige molecuulstructuren hebben. Ook kunnen ze met hun metingen herkennen op welke plaats het proton aan die fragmenten hecht. Dat is belangrijk omdat het proton fungeert als ladingsdrager die ervoor zorgt dat de moleculen in een massaspectrometer kunnen worden geanalyseerd. De nieuwe meetmethode levert nuttige informatie over de reacties die optreden tijdens het fragmentatieproces en daarmee tot een betrouwbaarder reconstructie van de volgorde van de aminozuren. De onderzoekers publiceren hun resultaten in het nummer van de Journal of the American Chemical Society dat medio december verschijnt. Het artikel gaat deze week online.
Hoewel het menselijke genoom (DNA) nu helemaal in kaart is gebracht, is daarmee de biologie van de cel nog lang niet volledig begrepen. Vrijwel alle functies van de cel worden uitgevoerd door eiwitten en het doorgronden van hun werking, dat wil zeggen het begrijpen van het 'proteoom', is de volgende grote uitdaging.
Vanwege haar hoge gevoeligheid is massaspectrometrie (MS) een van de belangrijkste instrumenten voor het identificeren van eiwitten. Eiwitten worden gewoonlijk met enzymen in kleinere stukken 'geknipt', tot peptiden. Het moleculair gewicht van die peptiden wordt met de massaspectrometer bepaald. In de massaspectrometer worden de peptiden via dissociatie in stukken gebroken en het fragmentatiepatroon bevat de puzzelstukjes waaruit de volgorde van aminozuren gereconstrueerd kan worden (dit heet 'sequencing'). Deze identificatie, die gebaseerd is op het vergelijken van de puzzelstukjes met die in grote databases, wordt tegenwoordig volledig automatisch uitgevoerd.
Deze identificatie is echter, onder andere door de gebrekkige kennis van de moleculaire fragmentatieprocessen, lang niet altijd eenduidig. Tijdens dissociatiereacties herschikken de atomen zich waardoor nieuwe moleculaire structuren ontstaan, en deze zijn experimenteel vrijwel niet bestudeerd. Standaardtechnieken zoals röntgenkristallografie en magnetische kernspinresonantie (NMR) zijn niet geschikt om deze fragmenten te onderzoeken omdat ze slechts kort en in extreem kleine hoeveelheden in een massaspectrometer bestaan. Nick Polfer en Jos Oomens van het FOM-Instituut voor Plasmafysica Rijnhuizen en Sándor Suhai en Béla Paisz van het Krebsforschungszentrum in Heidelberg zijn er nu voor het eerst in geslaagd informatie over de structuur van deze fragmenten te verkrijgen. Die informatie haalden ze uit infraroodspectra die ze van de fragmenten in de massaspectrometer wisten op te nemen.
De onderzoekers gebruikten daarvoor de Fourier Transform Massaspectrometer (FTMS) die gekoppeld is aan de bundellijn van de vrije-elektronenlaser FELIX in het FOM-Instituut Rijnhuizen. Met behulp van een electrospray ionisatiebron sloegen de onderzoekers intacte peptiden in de FTMS op, waar ze die peptiden verder in fragmenten opbraken door ze te laten botsen met een inert gas. Deze methode is gelijk aan die waarop peptiden worden 'ge-sequenced', zoals hierboven beschreven. In de FTMS wordt nu een van de fragmenten geïsoleerd door alle andere componenten massaselectief uit de FTMS te verwijderen. Dit fragment wordt vervolgens bestraald met FELIX. Wanneer de frequentie van het infrarode licht overeenkomt met een absorptieband van het molecuul, kan dat energie opnemen uit het stralingsveld. Hierdoor kan het molecuul uiteen vallen waardoor de massa verandert. De massaspectrometer meet nu deze veranderingen als functie van de golflengte van het ingestraalde licht en zo wordt een infraroodspectrum verkregen.
Het experimentele infraroodspectrum wordt vergeleken met spectra die berekend zijn voor verschillende structuren. Op deze manier is nu vast komen te staan dat voor een bepaald soort fragmenten zich ringstructuren vormen, die ontstaan door cyclisatiereacties tijdens het dissociatieproces. Verder kan in de spectra de plaats waar het proton zich aan het molecuul bindt herkend worden, én de plek waar zo'n ringstructuur zich sluit. Dit is van groot belang om beter te begrijpen wat er in volgende fragmentatiereacties gebeurt. Die reacties geven verdere informatie over de volgorde van de aminozuren en worden daarom in veel sequencingtechnieken toegepast.
In het algemeen levert kennis van de fragmentatiestructuren inzicht in de reactiepaden. Hieruit kan men informatie afleiden over de hoeveelheden verschillende fragmenten die ontstaan; die hoeveelheden vertalen zich in de intensiteiten van verschillende pieken in het massaspectrum. Bestaande sequencingtechnieken baseren zich alleen op de informatie over de massa. De informatie over de intensiteit wordt feitelijk weggegooid. De techniek die de onderzoekers nu hebben ontwikkeld geeft daarom meer inzicht in de dissociatiereacties die aan het 'sequencen' ten grondslag liggen.
Meer informatie bij dr. Jos Oomens, telefoon (030) - 609 69 99.