Zicht op de dynamica van afzonderlijke ligase-enzymen
Het enzym DNA-ligase herstelt DNA waarin een of beide van de strengen zijn gebroken, bijvoorbeeld als gevolg van ultraviolette straling. Onderzoekers van de Technische Universiteit Delft, de Stichting FOM en het Sloan Kettering Institute in New York hebben nu aan afzonderlijke ligase-enzymen weten te meten hoe ze dit teweeg brengen. Over het chemische mechanisme van DNA-ligase is veel bekend, maar over de fysische en dynamische aspecten daarvan veel minder. De nu uitgevoerde metingen verdiepen daarom het inzicht in de manier waarop de natuur beschadigd DNA herstelt. De onderzoekers hebben hun resultaten gepubliceerd in de Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) van 5 mei 2008.
DNA (zie figuur 1) bestaat uit de alom bekende dubbele wenteltrapstructuur. De leuningen worden gevormd door een structuur van suiker- en fosfaatmoleculen. De treden, die de genetische code omvatten, bestaan uit paren van in totaal slechts vier basen (adenine, guanine, cytosine en thymine) . Een base, een suiker en een fosfaat vormen samen een nucleotide. De twee strengen van het DNA-molecuul bestaan dus uit een groot aantal opeenvolgende nucleotiden. DNA-ligase lijmt gebroken DNA door het vormen van een covalente fosfodiesterverbinding tussen een hydroxyleind van één nucleotide en een fosfaateind van een ander nucleotide. De chemie van dit mechanisme is goed bekend, maardat geldt veel minder voor de dynamica van de ligase-enzymen.
Om die dynamica experimenteel toegankelijk te maken, hebben de onderzoekers een modelsysteem ontwikkeld. Ze zetten een stuk DNA vast tussen een glazen plaatje en een magnetisch bolletje. Met behulp van twee kleine magneten kunnen ze vervolgens aan het DNA draaien. Ze winden een deel van het DNA-molecuul zo sterk op, dat de windingen omklappen tot lussen (zoals je dat bij een schoenveter gemakkelijk kunt bereiken). Bij DNA worden die lussen coils genoemd. Als DNA-ligase gebruiken ze een van de eenvoudigste die er zijn, een ligase afkomstig uit het Chlorella virus. Dit ligase brengen ze in contact met het stuk DNA. Vervolgens halen ze een truc uit. Als je aan het ligase een overmaat adenosine monofosfaat (AMP) toevoegt, dan kan het zijn werking met een veel grotere waarschijnlijkheid dan normaal omkeren: er is een wezenlijke kans dat het ligase een fosfodiesterverbinding verbreekt (het ligase ‘knipt’ het DNA) In het experiment heeft dit knippen door ligase tot gevolg dat de lussen uit het DNA worden gehaald. Vervolgens kan het ligase ook weer zijn normale werking hervatten en de gebroken DNA uiteindes weer aan elkaar plakken. Na elke knip- en plakfase zijn er lussen uit het DNA verdwenen en is het DNA langer geworden (zie figuur 2). Het magnetisch bolletje heeft een nieuwe positie ingenomen en de verplaatsing is precies te meten.
De experimenten leren diverse dingen over het dynamische gedrag van het ligase, dat het DNA omklemt in de vorm van een C. De experimenten tonen bijvoorbeeld aan dat hoe beter het ligase dat doet, hoe efficiënter het proces van verwijderen van coils en weer vastplakken van de doorgeknipte strengen blijkt te verlopen. Ook bleek dat het ligase stabieler is naarmate Pde omklemming beter tot stand komt. Uit wrijvingsmetingen tussen het DNA en het ligase bleek dat het ligase zo'n driehonderd keer per seconde een breuk in het DNA kan lijmen. Vergelijkbare snelheden zijn bekend van een heel ander soort enzym dat ook fosfodiesterverbindingen tot stand brengt, namelijk de DNA-polymerase die DNA kopieert.
Meer zicht op het dynamische gedrag van ligase is niet alleen wetenschappelijk interessant, maar heeft ook praktisch nut. DNA-ligase speelt een belangrijke rol in de toepassing van moleculaire biologie in biotechnologie en synthetische biologie. Dan is het een groot voordeel als je processen in detail kunt sturen en optimaal laten verlopen.
Meer informatie bij prof.dr. Nynke Dekker, telefoon (015) 278 32 19.
Referentie: Dynamics of phosphodiester synthesis by DNA ligase, Aurélien Crut, Pravin Nair, Daniel Koster, Stewart Shuman en Nynke Dekker, Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 105, pag. 6894-6899 (5 mei 2008).